Utilización de la proteína multicomponente Quimera de Leishmania infantum en inmunoprofilaxis y diagnóstico de leishmaniosis canina
Las estrategias propuestas para el control de la leishmaniosis canina se centran en el desarrollo de nuevos fármacos y generaciones de vacunas, así como de sistemas de diagnóstico fiables que permitan un mejor control de las endemias y brotes epidémicos de las diferentes formas de esta enfermedad em...
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| Formato: | text (thesis) |
| Lenguaje: | spa |
| Publicado: |
Universidad de Extremadura (España)
2006
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| Acceso en línea: | https://dialnet.unirioja.es/servlet/oaites?codigo=581 |
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| Sumario: | Las estrategias propuestas para el control de la leishmaniosis canina se
centran en el desarrollo de nuevos fármacos y generaciones de vacunas, así
como de sistemas de diagnóstico fiables que permitan un mejor control de las
endemias y brotes epidémicos de las diferentes formas de esta enfermedad
emergente y en plena expansión.
El desarrollo de una vacuna, capaz de controlar la enfermedad y de
reducir significativamente la tasa de parásitos en los perros infectados, sería lo
más deseable para la comunidad veterinaria y para la implantación de
programas de control de la leishmaniosis visceral zoonótica. Además se hace
necesario la búsqueda de antígenos del parásito que puedan ser empleados
en el serodiagnóstico de la enfermedad.
El presente trabajo describe los resultados obtenidos tras el análisis y
cuantificación del grado de protección generado por la proteína Q de L.
infantum en su ensayo como vacuna en perros tras la infección experimental
de los animales. Igualmente se aportan datos relativos al efecto de dosis, vías
de administración y determinación de la mejor formulación de un adyuvante
para la PQ en su uso como vacuna contra la leishmaniosis canina. Además se
detallan en esta memoria los resultados obtenidos tras el análisis del uso de la
proteína Quimera como herramienta fiable de serodiagnóstico de dicha
enfermedad.
El modelo experimental (Sistema Test) para el desarrollo de estos
estudios fue la especie canina (Canis familiaris), siendo 34 los perros utilizados
para los ensayos de vacunación. Dichos animales procedían del Servicio de
Animalario de la Universidad de Extremadura, siendo algunos ejemplares
aportados por el Servicio de Animalario de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Murcia.Los animales eran de raza Beagle y mestizos (sin pureza racial alguna) y
con madurez inmunológica, siendo sus edades las comprendidas entre los 8 y
18 meses, de ambos sexos y con un peso corporal según su estándar racial.
Durante el desarrollo de los diferentes estudios, los animales permanecieron en
las instalaciones del Servicio de Animalario de la Universidad de Extremadura
del Campus Universitario de Cáceres, siendo las características de ubicación y
manejo las descritas en la normativa nacional y europea referentes al
cuidado y bienestar de animales de experimentación (Directiva del Consejo
de 24 de Noviembre de 1986 relativa a la protección de los animales utilizados
para experimentación y otros fines científicos (86/609/CEE)).
Las proteínas recombinantes utilizadas como vacunas fueron cedidas
por el Dr. Carlos Alonso Bedate, siendo aisladas y caracterizadas por el equipo
de investigación del centro de Biología Molecular ¿Severo Ochoa¿ de Madrid.
Se plantearon y se llevaron a cabo diferentes programas de vacunación
para cada grupo de perros. Así, los perros pertenecientes al grupo C fueron
inmunizados tres veces utilizando la proteína Q en adyuvante BCG, siendo la
vía de administración la intraperitoneal; los animales del grupo D fueron
inmunizados, igualmente tres veces con la proteína Quimera y la proteína de
membrana Kmp11, adyuvadas en BCG, pero a través de la vía subcutánea.
Igualmente se utilizó un grupo control de Adyuvante (Grupo A), siendo
vacunados con BCG y 3 perros a los que no se les administró ninguna sustancia
inmunogénica, pasando a ser los controles de la infección experimental
(Grupo T). Estos animales (Grupos C, D, A y T) fueron los utilizados en el ENSAYO
1 para comprobar los índices de protectividad frente al reto de la infección
experimental.
Los animales pertenecientes al grupo E fueron inmunizados una sola vez
con la vacuna marcada como PQ, administrada vía subcutánea y sin
adyuvante, mientras que a los del grupo F se les vacunó con la PQ, en adyuvante BCG, una sola vez, y empleando la vía subcutánea en dos
animales y la intraperitoneal en el resto. Por último los animales pertenecientes
a los grupos G, H e I fueron inmunizados vía subcutánea con una dosis de PQ
en adyuvante CpG/ODN, AlOH y QuilA, respectivamente. Igualmente se utilizó
un grupo control de Adyuvante (Grupo A¿). Todos estos últimos grupos
formaron parte del ENSAYO 2 referido al efecto de dosis, vías y adyuvantes
sobre la respuesta inmune humoral frente a la PQ.
Una vez demostrada la inocuidad de estas sustancias y la eficacia de
estos productos como estimuladores del sistema inmune, los perros
pertenecientes a los grupos C (PQ-BCG), D (PQ-Kmp11-BCG), A (BCG) y T (PBS)
fueron sometidos al reto de la infección experimental (por inoculación
endovenosa de 500.000 formas promastigote del parásito).
La especie de Leishmania utilizada para su uso en la infección
experimental, así como para la obtención de antígeno total soluble del
parásito fue Leishmania infantum con código de la OMS M/CAN/ES/96/BCN
150 tipificado como zimodema 1 y aislada en nuestro Laboratorio a partir de
un perro con leishmaniosis visceral naturalmente adquirida.
A lo largo de la experiencia se llevaron a cabo diferentes estudios
clínicos, parasitológicos, inmunológicos y biopatológicos in vivo, concluyendo
la experiencia con el sacrificio de los animales de estudio y posterior
realización de la necropsia reglada y análisis histopatológico de las muestras y
tejidos obtenidos.
Para los estudios de fiabilidad diagnóstica, incluídos en el ENSAYO 3, se
analizaron un total de de 142 sueros caninos, procedentes de nuestros archivos
de historias clínicas y muestras biológicas congeladas, obtenidas en la consulta
de Parasitología y Enfermedades Parasitarias del Hospital Clínico Veterinario
sito en la Facultad de Veterinaria de Cáceres. Así se testaron diferentes sueros
de perros sanos (Grupo 1), sueros de perros con patologías diversas propias de la especie, excluyendo la infección por Leishmania infantum (Grupo 2), y un
grupo de sueros de perros con leishmaniosis confirmada por distintas técnicas
(Grupo 3). Por último se sometió a estudio un grupo de 10 perros con
leishmaniosis canina, tratados con antimoniales y alopurinol antes y después
del tratamiento (Grupo 4).
El estudio de la eficacia diagnóstica de la proteína Q se llevó a cabo a
través del análisis comparativo entre las técnicas más frecuentemente
empleadas en el serodiagnóstico de la leishmaniosis canina, la técnica de
Inmunofluorescencia Indirecta y la técnica de micro-ELISA indirecto con el
habitual extracto crudo soluble como antígeno (SLA), frente al antígeno
multicomponente recombinate PQ de L. infantum, tanto en el formato ELISA
como en el inmunocromatográfico.
En los ensayos de vacunación se pudo demostrar la capacidad
inmunoestimuladora de la proteína Quimera de L. infantum, ya que indujo sola
(Grupo E) o independientemente del adyuvante utilizado (resto de grupos),
una respuesta positiva de anticuerpos durante todo el periodo de
inmunización. Asímismo se pudo comprobar la inocuidad de las sustancias
vacunales por cuanto no se observaron fenómenos de hipersensibilidad o
toxicidad en los animales vacunados.
Respecto a la respuesta de anticuerpos mediada por las dos subclases
de inmunoglobulinas, los datos obtenidos mostraron una intensa activación de
la subclase IgG2 en todos los grupos de animales, al ser enfrentados sus sueros
a los antígenos homólogos, mientras que los niveles de IgG1 observados fueron
muy variables, siendo significativos sólo en los animales inmunizados con PQ en
adyuvante CpG/ODN, AlOH y Quil A, respectivamente.
Así, la vía subcutánea y el empleo de dichos adyuvantes determinaron
la mayor precocidad, intensidad y duración de la respuesta inmune, siendo el efecto de dosis y número de inoculaciones un factor de importancia mínima
en la activación de dicha respuesta.
Los resultados pusieron de manifiesto, igualmente que la respuesta
inmunológica de base humoral fue específica para los determinantes
antigénicos utilizados. El uso de la proteína Q en posibles planes de
inmunprofilaxis de la leishmaniosis canina permitiría distinguir entre anticuerpos
vacunales y de infección, ya que durante el periodo de inmunización la
seropositividad por ELISA quedó exclusivamente restringida a este antígeno
multicomponente, siendo las técnicas de IFI y ELISA (proteínas totales)
negativas en los perros vacunados de todos los grupos, con la excepción de
los inmunizados con Kmp11. Así, dicho antígeno de membrana utilizado como
vacuna generaría anticuerpos crorreactivos frente a antígenos totales por la
técnica ELISA.
La infección experimental llevada a cabo fue totalmente efectiva,
desarrollándose en todos los casos una leishmaniosis canina de tipo crónico
expresada en formas latentes de escasa sintomatología y formas patentes o
sintomáticas.
Sin duda el éxito de la infección experimental permitió el análisis
completo de los grados de protectividad obtenidos por el uso de las vacunas y
el conocimiento de los posibles mecanismos involucrados.
Así, y desde el punto de vista clínico, los animales vacunados no
presentaron síntomas o alteraciones analíticas propias de la enfermedad. Los
resultados parasitológicos demostraron la capacidad de la PQ para controlar
el desarrollo de la infección, siendo los títulos por IFI en dichos animales
negativos o basales durante toda la experiencia. El Test de Montenegro fue
claramente positivo en todos los perros vacunados y los estudios
anatomopatológicos e histológicos mostraron la ausencia de las lesiones
propias de la leishmaniosis visceral a nivel hepático, renal o linforreticular. Por el contrario los animales control de Adyuvante (Grupo A) y no
inmunizados (Grupo T) mostraron ya a los 150 días tras la infección y hasta el
final del estudio signos de enfermedad, junto a niveles de anticuerpos
claramente positivos por IFI y ELISA (tanto al SLA como a los de membrana
Kmp11). La respuesta inmune de base celular mediante la DTH fue inexistente y
en dichos perros fueron aislados parásitos durante todo el periodo de análisis.
Los estudios anatomopatológicos e histológicos pusieron de manifiesto la
existencia en los animales testigos de las típicas lesiones propias de esta
enfermedad como distintos tipos de glomerulonefritis y nefritis intersticial,
hepatitis, etc.
Tras interpretar los resultados obtenidos en los estudios de diagnóstico,
podemos afirmar que el empleo el antígeno recombinante PQ de L. infantum
ofrece una alta fiabilidad en el serodiagnóstico de la leishmaniosis canina, y
un cierto valor pronóstico por cuanto fue capaz de detectar seropositividad en
aquellas formas susceptibles con enfermedad establecida (formas
sintomáticas) o evolutivas (formas latentes en fases preclínicas), y mostrar
reacción negativa de anticuerpos en aquellos perros presumiblemente con
respuesta inmunitaria baja y de control al desarrollo de la enfermedad (formas
regresivas y latentes no evolutivas). Además, la mejoría clínica y eliminación de
parásitos que acompaña a un tratamiento leishmanicida efectivo, se tradujo
en una seroconversión hacia la negatividad frente a los componentes del
antígeno, de forma similar a lo que se observó cuando se empleó la técnica
IFI.
En vista de los resultados obtenidos podemos concluir que la proteína
recombinante multicomponente Quimera de Leishmania infantum se muestra
como una excelente herramienta para el control de la leishmaniosis canina
por cuanto se muestra como una herramienta fiable de diagnóstico y un
excelente candidato vacunal. |
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